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    抗體體外親和力成熟

    02-07

    抗體親和力成熟(antibody affinity maturation)是動(dòng)物免疫系統擁有的一種免疫功能狀態(tài)。在體液免疫中,再次應答所產(chǎn)生抗體的平均親和力高于初次免疫應答,這種現象稱(chēng)為抗體親和力成熟。其作用原理是由于抗體形成細胞本身的基因突變和抗原對B細胞克隆的選擇性激活。動(dòng)物免疫系…

    抗體親和力成熟(antibody affinity maturation)是動(dòng)物免疫系統擁有的一種免疫功能狀態(tài)。在體液免疫中,再次應答所產(chǎn)生抗體的平均親和力高于初次免疫應答,這種現象稱(chēng)為抗體親和力成熟。其作用原理是由于抗體形成細胞本身的基因突變和抗原對B細胞克隆的選擇性激活。動(dòng)物免疫系統的這種功能狀態(tài)是長(cháng)期進(jìn)化和對外界環(huán)境不斷適應的結果,對防御和維持自身免疫監控有著(zhù)十分重要的意義。

    單克隆抗體已廣泛地應用于臨床治療。目前,單克隆抗體的研發(fā)主要基于雜交瘤細胞或者體外抗體庫,通過(guò)抗原和抗體親和力篩選和功能驗證,得到有藥用潛力的抗體。在實(shí)際研發(fā)過(guò)程中,經(jīng)過(guò)常規篩選所得的抗體,有諸多方面需要更細致的改進(jìn),包括親和力、免疫原性、半衰期等??贵w親和力的提高有助于改善抗體的特異性和效力,有助于減少用藥劑量,降低毒副作用等。發(fā)展抗體體外親和力成熟的技術(shù),不僅能夠促進(jìn)抗體藥物的研發(fā)和質(zhì)量改善,同時(shí)也能幫助我們更好地理解抗體與抗原靶點(diǎn)相互作用的機理,更好地認識抗原靶點(diǎn)的功能。

    基于抗體庫的抗體體外親和力成熟與基于體外抗體庫的抗體篩選沒(méi)有本質(zhì)差別,都是體外篩選高親和力抗體,其重點(diǎn)主要是兩個(gè)方面,即抗體庫的構建和篩選系統的選擇。區別在于,抗體篩選所用的抗體庫在構建或合成時(shí)無(wú)偏向性,而抗體體外親和力成熟所用的抗體庫是基于確定的抗體序列模板所構建。

    針對抗體體外親和力成熟的建庫策略可以大致分為兩個(gè)類(lèi)別:一類(lèi)是構建大的抗體庫,將抗體互補決定區域(CDR區域)甚至整個(gè)V區做隨機突變;另一類(lèi)是構建小的抗體庫,將突變集中于抗體序列上特定的區域。 抗體大庫構建的方法主要有:CDR walking、chain shuffling、DNA shuffling、error-prone PCR等。1)CDR walking是分段隨機突變同時(shí)保證相鄰兩個(gè)突變區域有所重疊,從而使突變覆蓋整個(gè)CDR區域。(2)Chain shuffling是將抗體的VH和VL的配對重新洗牌。(3)DNA shuffling是將抗體V區的序列重新洗牌,其突變不限于CDR區,也包括FR區域。4)error-prone PCR則是對抗體進(jìn)行隨機突變。這些方法所構建的庫的容量較大,工作量也較大。 與抗體大庫的構建相比,抗體小庫構建更有序列針對性。1)可以選擇對抗體重鏈CDR3區域進(jìn)行隨機突變,因為重鏈 CDR3區域被認為通常對抗原抗體結合起關(guān)鍵作用。(2)另一種方法可以在抗體輕鏈和重鏈的6個(gè)CDR區域的所有氨基酸上進(jìn)行突變,每一個(gè)氨基酸分別被突變成其他19個(gè)氨基酸(飽和突變),構成抗體飽和突變庫。通過(guò)篩選抗體飽和突變庫,可以識別出高親和力的突變熱點(diǎn)。通過(guò)組合這些突變熱點(diǎn),構建一個(gè)組合突變庫,再進(jìn)行篩選可以找到具有更高親和力的組合。這種方法可以提高篩選效率,有效獲得高親和力抗體序列。3)胚系基因熱點(diǎn)(germline hotspots)是體細胞高頻突變過(guò)程中的優(yōu)先突變區域,幾乎都處于CDR區域內部,對抗體的親和力提高起到關(guān)鍵作用,因此體外親和力成熟時(shí)可優(yōu)先考慮抗體的germline hotspots突變區域,在這些熱點(diǎn)位置進(jìn)行突變,構建抗體小庫進(jìn)行篩選。4)當抗體抗原復合物的結構被解析之后,可以通過(guò)分析兩者相互作用的位點(diǎn)信息,進(jìn)而進(jìn)行更精確的突變和建庫,有效獲得高親和力抗體序列。

    展示技術(shù)廣泛用于抗體體外親和力成熟。目前常用的噬菌體表面展示和酵母表面展示技術(shù)只能展示小分子片段抗體,如抗原結合片段(Fab),單鏈可變區抗體片段(scFv)等,無(wú)法展示并篩選全長(cháng)抗體。通過(guò)噬菌體和酵母表面展示技術(shù)篩選出的抗體片段,需要進(jìn)行結構轉換,將抗體的片段結構轉換成IgG全長(cháng)抗體結構,應用于抗體藥物開(kāi)發(fā)。但是通過(guò)結構轉換形成的全長(cháng)抗體可能會(huì )部分或全部失去對抗原的結合活性,需要對轉換后的全長(cháng)抗體進(jìn)一步進(jìn)行體外成熟優(yōu)化,才能篩選出具有高親和力的抗體。

    最直接的策略是通過(guò)展示IgG全長(cháng)抗體,進(jìn)行體外親和力成熟優(yōu)化篩選。哺乳動(dòng)物細胞表面展示技術(shù)能夠有效地展示IgG全長(cháng)抗體,還能夠利用真核表達系統指導抗體的正確折疊,提供人源N型糖基化等多種翻譯后加工功能,因而展示的抗體在分子結構、理化特性 和生物學(xué)功能方面最接近于天然的IgG全長(cháng)抗體。但是與噬菌體展示和酵母展示技術(shù)相比,哺乳動(dòng)物細胞表面展示技術(shù)通量小,操作難度大,周期長(cháng),成本高,無(wú)法高效達到體外親和力成熟的目標。

    糖工程畢赤酵母具有類(lèi)似于哺乳動(dòng)物細胞的真核表達系統質(zhì)量控制機制,能確??贵w的正確折疊,具有人源N型糖基化等多種翻譯后加工功能。糖工程畢赤酵母細胞表面展示技術(shù)能夠有效地展示IgG全長(cháng)抗體,其表面展示的IgG抗體在分子結構、理化特性和生物學(xué)功能方面接近于天然抗體。與哺乳動(dòng)物細胞展示技術(shù)相比,糖工程畢赤酵母展示技術(shù)具有抗體庫容量大,操作簡(jiǎn)單,周期短,成本低,能高通量篩選IgG全長(cháng)抗體。糖工程畢赤酵母可以代替噬菌體、酵母細胞展示技術(shù),構建大容量人源IgG全長(cháng)抗體庫,進(jìn)行高通量親和力體外成熟篩選,選出的高親和力、高表達IgG全長(cháng)抗體不需要結構形式改變,可以直接表達生產(chǎn)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗和臨床實(shí)驗,是一種穩定高效的抗體親和力成熟系統。因此糖工程畢赤酵母展示技術(shù)具有其他展示技術(shù)沒(méi)有的潛在優(yōu)勢。

    免疫磁珠分離技術(shù)(MACs)和流式細胞分選(FACs)可以高通量篩選富集與靶標抗原特異性結合抗體。免疫磁珠法分離細胞基于糖工程畢赤酵母和哺乳動(dòng)物細胞表面抗體能與連接在磁珠上的抗原相結合,在外磁場(chǎng)中細胞通過(guò)表面展示的高親和力抗體與抗原磁珠相連被吸附而滯留在磁場(chǎng)中,細胞表面展示的抗體如果沒(méi)有親和力,則不能與抗原磁珠結合而沒(méi)有磁性,不會(huì )在磁場(chǎng)中停留。FACS分選技術(shù)可以同時(shí)根據IgG全長(cháng)抗體親和力及表達展示水平進(jìn)行篩選,可以消除表達水平不同引起的偏差,而且能區分親和力不同的克隆,一次直接分選不同親和力的抗體克隆。

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